激光共聚焦显微镜的生物样品如何制备

激光共聚焦显微镜的生物样品制备是一个复杂而精细的过程，旨在确保样品在显微镜下能够呈现高质量的成像效果。以下是生物样品制备的主要步骤及注意事项：

一、样品准备

选择合适的样品：根据实验目的和研究需求，选择合适的细胞或组织样品。样品应具备良好的生物活性和显微结构，如活体细胞、培养细胞、组织切片等。

样品预处理：对于细胞样品，可以使用细胞爬片、培养皿等方法进行制备。细胞爬片时，需选择质量好、光洁、无杂质的载玻片和盖玻片，并进行相应的处理以确保其光学特性。对于组织样品，通常需要进行切片处理，切片越薄越好，以便于单层组织标本能很好地贴附在样品池中。

二、样品固定

为了保持样品的形态和结构，需要进行样品的固定处理。常用的固定方法包括化学固定和物理固定：

化学固定：使用甲醛、乙醇、冰醋酸、戊醛等化学试剂进行固定。例如，组织样本可以浸泡在缓冲福尔马林中，然后进行脱水和浸渍。实验室中常用的还有液氮冷冻法和多聚甲醛(PFA)固定法。液氮冷冻法是将新鲜组织直接放入液氮中保存；而多聚甲醛固定法则是将组织块置于4% PFA中进行后固定，固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整。

物理固定：对于一些特殊的样品，也可以采用物理方法进行固定，如冷冻固定等。

三、渗透处理

有些样品在固定后会出现浸泡不透的情况，此时需要进行渗透处理，使固定液更好地渗透进入样品中。常用的渗透处理方法包括冷冻冰醋酸渗透、冷冻减压渗透、甘油渗透等。

四、包埋

将处理好的样品包埋到透明的固定剂中，以保持其形态和结构。常用的包埋介质包括琼脂、明胶、聚乙二醇、树脂等。包埋时要注意使样品均匀分布在包埋剂中，以免出现偏移或扭曲。

五、切片

将包埋好的样品切割成适当的厚度，通常为几十微米至几百微米。切片的方法有冰刀切片、冷冻切片、石蜡切片等。切片时需保持样品的完整性和结构。

六、平片处理

将切好的样品平片放在载玻片上，用适当的方法将其固定在玻片上。常用的固定方法有热熔、冷冻、电荷吸附等。固定后要确保样品牢固地固定在玻片上并保持平坦。

七、染色与标记

根据需要，可以对样品进行染色以增强显微镜观察的效果。常用的染色方法有荧光染色、荧光蛋白标记、核酸染色等。此外，样品还需经荧光探剂标记，以便于在激光共聚焦显微镜下进行观察。标记方法可包括单标、双标、三标等。荧光染料的选择应根据激光器的波长来确定，以避免串色问题。

八、清洗与封片

处理完样品后，要对样品进行适当的清洗，去除余留的固定剂、染色剂等。然后，将处理好的样品加入封片介质，如卡宾胶、密封剂等，以减少光透射损失和防止样品变干。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应使用抗荧光淬灭的封片剂以减少荧光信号的损失。

九、显微镜观察

将制备好的样品放入激光共聚焦显微镜中，调整焦距和曝光时间，进行观察和拍摄。

注意事项

样品类型：样品可以是固定的或活的组织，也可以是固定的或活的贴壁培养细胞。对于悬浮细胞或悬浮粒子，应使用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。

样品厚度：样品的厚度应适中，一般为1~2mm，以便于激光穿透和成像。

载玻片和盖玻片的选择：应选择质量好、光洁、无杂质的载玻片和盖玻片。重要实验需提前检查其光学特性，确保无荧光干扰。盖玻片的厚度应小于0.17mm，载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间。

操作规范与安全防护：在制备样品过程中应严格遵守操作规程，避免污染和损坏样品。同时，应注意保护激光管免受损坏，避免暴露在中等功率和高功率的激光辐射中。

综上所述，激光共聚焦显微镜的生物样品制备需要精细的操作和严格的控制，以确保样品的质量和成像效果。