各厂家超分显微镜技术的介绍

1、 莱卡公司采用的超分辨技术 STED
2000 年，德国科学家 StefanHell 开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率。当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态。利用这个特性，Hell 等开发出了受激发射损耗显微技术 (stimulated emission depletion，STED)。其基本的实现过程如图 2 所示，就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第Y束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率，原理见下图。

STED 成像技术的*大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛。

2、 蔡司公司采用的超分辨技术 PLAM
2002 年，Patterson 和 Lippincott‐Schwartz 首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹。这种荧光蛋白 PA‐GFP 在未激活之前不发光，用 405nm 的激光激活一段时间后才可以观察到 488nm 激光激发出来的绿色荧光。德国科学家EricBetzig 敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的J限。2006 年 9月，Betzig 和 Lippincott‐Schwartz 等首次在 Science 上提出了光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy，PALM)的概念。其基本原理是用 PA‐GFP 来标记蛋白质，通过调节 405nm 激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用 488nm 激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。在确定这些分子的位置后，再长时间使用 488nm 激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来。之后，分别用 405nm 和 488nm 激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位。将这些分子的图像合成到一张图上，*后得到了一种比传统光学显微镜至少高 10 倍以上分辨率的显微技术，原理如下：

PLAM 通过定位细微结构乃至单分子，实现 20 nm 的横向分辨率和 50 nm 轴向分辨率。

3、 尼康公司采用的超分辨技术 STROM 和 SIM STROM
2006 年底，美国霍华德‐休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出来一种类似于 PALM 的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨率定位。他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子 Cy5 在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色 561nm 的激光可以激活 Cy5 发射荧光，同时长时间照射可以将 Cy5 分子转换成暗态不发光。之后，用绿色的 488nm 激光照射 Cy5 分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第E个荧光分子 Cy3 与 Cy5 之间的距离。因此，当 Cy3 和 Cy5 交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性。将 Cy3 和 Cy5 分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白。应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到*后的内源蛋白的高分辨率影像，被他们命名为随机光学重构显微技术 (stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)。2007 年，他们进一步改进 STORM 技术，发展了不同颜色的变色荧光分子对，可以同时记录两种甚至多种蛋白质的空间相对定位，从而阐明笼形蛋白 clathrin 形成的内吞小泡与细胞骨架蛋白之间的精确空间位置关系，两种颜色的分辨率都可以达到 20～30nm。原理如下图：

STORM 通过一对染料对通过随机发光空间定位，实现了 XY 20 nm 分辨率。

SIM
改变光学的点扩散函数来突破光学J限的另一个方法是利用饱和结构照明显微技术(saturated structure illumination microscopy，SSIM)。早在 1963 年，Lukosz 和 Marchand 就提出了特定模式侧向入射的光线可以用来增强显微镜分辨率的理论。2005 年，加州大学旧金山分校的 Gustafsson 博士首先将非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜上，得到了分辨率达到 50nm 的图像。SSIM 技术的原理是将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。如图所示：

SIM 通过结构照明莫尔纹原理实现了任何荧光染料都可以达到 XY 100nm。 

4、 奥林巴斯公司采用的 OSR 技术
图像超分辨率重构(super resolution。SR)是指利用计算机将一幅低分辨率图像（low resolution，LR）或图像序列进行处理，恢复出高分辨率图像（high resolution，HR）的一种图像处理技术。奥林巴斯超分辨技术通过高倍 60X 或者 100X 油镜，通过缩小共聚焦上的针孔，用强激光将样品扫描 20~50 次后通过软件进行运算重构，此技术存在一定的局限性：
①要使用高倍油镜低倍不适用
②因缩小针孔需使用强激光对样品损伤比较大。
③对样品扫描 20~50 次，样品荧光淬灭严重，更不适用于活细胞。
④环境要求较高，在做 20~50 次的过程中因环境振动等引起*后软件运算不准确。
⑤共聚焦图片均为软件着色，不能做多色荧光标记，容易引起串色。