突破光学衍射J限的超分辨成像技术

来源：小小光08 

1引言根据阿贝定律，当一个点光源经过一个完善的光学系统后，由于光的衍射效应，z终仍然形成的是一个模糊的光斑像(艾里斑)，光斑的半峰全宽满足FWHM≈0.61λ/NA，其中λ为该光学系统的工作波长，NA为该光学系统的数值孔径。上式也是一个点扩展函数(PSF)的半高全宽的描述。它说明：如果一次把处于这个半径里面的粒子亮起来，那用光学显微是无法分辨它们的。所以，这个公式也就是光学显微分辨率的描述。一个光学成像系统的分辨率取决于两个点光源像之间的z小距离，如果要提高成像分辨率，则需减小其工作波长或提高系统的数值孔径(通常采用高数值孔径的物镜)。对于常见的工作在可见光波段的光学显微镜，其分辨率J约为200nm。那么如何在现有的情况下进一步提高系统的成像分辨率，从而突破衍射J限限制的分辨率成像呢？随着科研人员的不断探索，通过多种不同的光学系统设计，小于100nm的分辨率得以实现。这些可以突破衍射J限成像的高分辨率光学显微技术，称为超分辨成像技术。根据其原理的不同，现有的超分辨成像技术可以分为两大类：一类是基于单分子定位成像的方法，利用特殊荧光分子的光开关特性或者其他机制在不同时刻随机激发稀疏的荧光点，通过相应算法对荧光分子进行定位；另一类是改造成像系统的点扩散函数，进而实现突破衍射J限分辨率的成像。2 基于单分子定位的超分辨成像第Y类方法基于分子定位实现的超分辨成像，主要包括光激活定位显微技术(Photoactivated localization microscopy, PALM)和随机光学重构显微技术(Stochas-tic optical reconstruction microscopy, STORM)。具有光开关特性的荧光蛋白是这类技术的关键。2002年，Patterson等头次发现了一种荧光蛋白PA-GFP，它在未激活状态下不发光，用405nm的激光激活一段时间后，才能被488nm激发光激发，发出绿色荧光信号。2006年，Betzig 等利用这种具有开关特性的荧光蛋白结合单分子荧光成像技术，头次提出了PALM。

图1：PALM用于观察溶酶体跨膜蛋白同年，庄小威等利用荧光蛋白Cy5在不同激发波长下表现出的开关特性，提出了“随机光学重构显微技术 (STORM) ”。

图2：STORM技术原理当两个发光团太接近的时候，传统显微镜不能分辨。庄小威的想法就是，如果能够用两种颜色的光，一束通过光漂白，让大部分粒子激发过度到达暗态；另一束通过激活，让J个别暗态的粒子再激活过来。由于激活的是J少数。这样，就有一部分粒子是只有自己发光、周边都是不发光的，就可以很容易地把它定位出来；把它激发、漂白，再激发另外的一些粒子，如此往复。而且，她发现了一个重要的Cy3-Cy5对，发不同颜色的光，这一对荧光团过去被用在荧光共振能量转移FRET成像研究中。庄小威在进行感冒病毒的研究中偶然发现，这一对可爱的蛋白能够像开关一样，通过光控制它们或者发荧光，或者不发荧光。PALM与STORM的原理大致相同，都是利用反复激活-漂白荧光分子，从而获得稀疏的荧光分子的位置信息，经过上百次的循环迭代，将得到的细胞内所有荧光分子的精确定位重构到同一张图像上，z后可以获得分辨率比传统光学显微镜至少高10倍的显微图像。不同的是，STORM可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨定位。然而，从PALM和STORM的基本原理中可以发现，这两类超分辨成像技术所依赖的还是传统的光学显微系统，其光学点扩散函数并没有发生改变，即单次成像分辨率依然处于衍射J限内，它是“用时间换空间”，通过牺牲时间分辨率来获得高的空间分辨率。3基于点扩散函数改造的超分辨成像这类方法通过改造光源来压缩光学系统的点扩散函数(PSF)，实现超分辨成像，这类成像手段主要包括受激发射损耗(Stimulated emission depletion, STED)显微技术，结构光照明显微技术(structured illumination microscopy, SIM)，可逆饱和线性荧光跃迁(reversible saturable optical linear fluorescence transitions)显微技术等。STED显微技术z早于1994年，由Stefan W. Hell等提出，通过受激发射损耗的方式来改变荧光基团发射荧光的点扩散函数。一些荧光分子在激发光照明下处于激发态，但当用另一束比激发光波长更长的激光照射时，荧光分子可以从激发态猝灭回到基态，即在两束激光同时照射时发光。基于这样一种荧光特性，Hell等用一束激光照射样品的同时，用另一束高能脉冲激光形成紧挨的环形激光照明，波长比激发光稍长，这样被短波激发的荧光大部分通过受激发射损耗的过程猝灭，压缩了点扩散函数，提高了显微镜的分辨率。然而STED的成像需要对样品进行点扫描，并且所采用的激光光强过大，可能导致观测样品的光漂白甚至光毒性。同时STED成像的光路复杂，系统搭建成本也较高。

图3：典型的STED系统结构示意图图3中，绿箭头代表粒子被激发从低能级S0到高能级S1，然后粒子会弛豫到亚稳态---高能级的z低点。接下来粒子会在这里停留很短的时间（短到几个ns），然后粒子再回到低能级S0。这是绝大多数电子的选择。跳下来的时候它们会降落在S0能级的不同高处，并形成一定的分布。还是在图3中，如果绿色箭头引发的荧光现象的z小PSF是绿色的圆圈半径，这时候如果给它套上一个红色橡皮擦（粒子做受激辐射波长相同），那剩下的就是为数不多、居于中间的荧光了，这样就缩小了点扩展函数，实现了超分辨。在实验操作上，选一种合适的荧光物质，按顺序先给激发脉冲(2ps左右)，等它跃迁上去了马上给一个受激辐射波长的脉冲（250ps左右），然后用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测过来的自发辐射信号。受激辐射越大（橡皮擦得干净），剩下的PSF越小，也就是分辨率越高。这个就是Pulsed STED.也可以给连续信号，因为二向色镜都能区分，只不过擦得没那么干净了，这个就是CW STED。不同于STED需要经过逐点扫描成像，SIM是一种宽场显微成像技术，可以获得更高的成像速度，更适合活体、低漂白的生物研究。SIM利用非均匀的正弦条纹照明光照明样品，当被测样品精细形貌与条纹状照明光相互叠加时，可以获得一个比两者空间频率都低的“莫尔条纹”。而这个莫尔条纹中同时带有样品和照明光的信息，换句话说，利用结构光照明可以将无法被光学系统采集的高频样品信息编码形成空间频率相对较低、可以被收集的莫尔条纹信号。利用后期图像重构技术，样品的高频信息可以重现在所获得的图像上，从而实现了突破衍射J限的超分辨成像。同时利用多束光干涉的办法，可以将二维结构光照明成像扩展到三维成像领域。目前已经实现横向100nm，轴向200nm左右的分辨率。虽然 SIM的分辨率低于其他超分辨成像技术，但其方法简单，不需要特殊的荧光标记，同时可以实现快速、动态、三维的超分辨成像。

图4：超分辨SIM的物理原理基于莫尔条纹和频谱扩展共聚焦通过一个点照明，加一个针孔实现分辨率提升。准确地说，由于在分辨率上，光噪声总是带来干扰，所以用一个针孔把光噪声去除，就能够将分辨率提升。共聚焦可以提升1.4倍分辨率，因为即使针孔小到只有一个点，根据光路可逆原理，这个点到了样品上也有点扩展函数那么大，z终，共聚焦的点扩展函数就是激发光的点扩展乘以针孔点扩展。共聚焦通过阻挡接收实现分辨率提升，而SIM则是通过给照明光一个调制实现分辨率提升。如果将SIM的结构调制通过共轭放在接收端，则SIM也是一个一维调制。进一步，通过从多个角度进行一维限制，可以z终得到二维的分辨率提升。目前，比较流行的是每隔120度进行一次，SIM可以提升2倍的分辨率。

图5：SIM超分辨成像（右）总的来说，由于光学衍射效应所带来的成像分辨率的限制，通过单分子定位和改造光学系统点扩散函数的方式，牺牲一定时间分辨率来获得突破衍射J限的成像，是目前的主流方法。除上述所提到的依据荧光成像原理的远场超分辨成像技术外，采用近场扫描光学显微技术(NSOM)也可以获得突破衍射J限的成像。近场光学成像不同于经典光学，其探针距样品仅波长量级的长度，可以收集远场成像所收集不到的近场信息，进而获得与原子力显微镜相当的成像分辨率。4 国内对超分辨成像技术的研究进展目前国内对超分辨成像技术已经展开了广泛而深入的研究。

图6：DMD-SIM实验光路图中国科学院西安光学精密机械研究所采用数字微镜器件（DMD）和LED照明的结构光照明方案，减少了散斑干涉等不利因素造成的背景噪声，能够获得90nm的空间分辨率以及190ms的切片速度。

图7：两种方法提高活细胞显微成像的分辨率。左图：双色高数值孔径物镜的全内反射结构光显微成像技术（highNA TIRF-SIM）。紫色：激动蛋白（actin）；绿色：内吞小泡（CCP）。右图：基于非线性激活Skylan-NS标记的激动蛋白的非线性结构光照明（PA NL-SIM）成像。2015年，中国科学院生物物理研究所与美国霍华德·休斯医学研究所等单位的科学家在《科学》上发表利用一种新型反复激活荧光蛋白Skylan-NS和结构光激活非线性SIM技术，获得了在细胞运动和改变形状的过程中骨架蛋白的解体和自组装过程，以及在细胞膜表面称为“caveolae”的微小内吞体动态过程的影像，其分辨率能达到62nm。

图8：宽场成像和超分辨JT-SOFI成像的比较（Scale bar:1um）2015年，北京大学席鹏结合了量子点、光谱方法和SOFI超分辨技术，在普通宽场显微镜上，实现了3s获得85nm的超高时空分辨率的成像，使用不同发射波长的量子点的联合标记，有效减少了高阶成像的伪影，更加真实地还原出生物样品的完整结构和细节信息。

图9: 纳米线环形照明显微术机理示意图(a)及“ZJU”结构观察效果图(b)

2017年，浙江大学杨青、刘旭将纳米线作为局域光源，提出了一种称为“纳米线环形照明显微术”(Nanowire ring illumination microscopy, NWRIM)的技术，头次实现了大视场、无标记的超分辨成像，其视场目前达数千平方微米，比以往报道的无标记型远场超分辨显微方法扩展了1个数量级以上。

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